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Contracepção
Genética para Plantações GM
Pesquisadores
canadenses desenvolveram um método para impedir a
disseminação de plantações geneticamente
modificadas (GM), mas permitindo aos agricultores o re-plantio ano
após ano. Uma das maiores preocupações em
relação às plantações GM é
que as plantas modificadas possam se cruzar com plantas nativas ou
com outras espécies da plantação, transmitindo
assim os traços modificados. No artigo #6833, Johann
Schernthaner e colaboradores descrevem uma nova técnica para
impedir que plantas GM se cruzem com espécies relacionadas.
Os
pesquisadores inseriram um gene para a letalidade da semente (SL)
nas plantas de tabaco. As plantas mostraram crescimento e
produção de sementes normais, mas devido ao gene SL, as
sementes não germinaram. Cruzando a planta infértil SL
com outra planta de tabaco modificada contendo o gene que reprime o
gene SL, os pesquisadores produziram uma geração filha
com sementes viáveis. Esta geração filha
teoricamente poderia propagar-se indefinidamente através da
auto-polinização, dizem os autores. Entretanto, quando
plantas desta mesma geração filha foram cruzadas com
plantas de tabaco nativas, o gene SL e o gene repressor foram
separados, e as sementes sem o gene repressor não conseguiram
germinar. Os autores concluíram que a
disseminação indesejável de novos traços
pode ser impedida, ligando-se os traços ao gene SL.
Controle
da germinação de sementes em plantas transgênicas
baseado na segregação de um sistema genético de
dois componentes.
Johann
P. Schernthaner*†, Steven F. Fabijanski‡, Paul G.
Arnison‡, Martine Racicot*§, and Laurian S. Robert*
*Eastern
Cereal and Oilseed Research Center, Agriculture and Agri-Food
Canada, 960 Carling Avenue, Ottawa, Canada K1A0C6; and ‡The FAAR
Biotechnology
Group, Suite 323, 5929 Jeanne d'Arc Boulevard, Ottawa, Canada K1C7K2
Ediado
por Charles J. Arntzen, Universidade do Estado do Arizona, Tempe,
AZ, e aprovado em 21 d Março de 2003 (recebido para
revisão em 8 de Novembro de 2002)
Desenvolvemos
um sistema repressor de letalidade à semente (SL) com o
objetivo de reduzir a probabilidade de intromissão de
transgênicos numa população de plantas
sexualmente compatíveis. Para avaliar o potencial deste
método, plantas de tabaco foram transformadas com uma linhagem
SL do gene 1 e gene 2 do Agrobacterium tumefaciens, enquanto que o
gene 1 foi controlado pelo promotor de phaseolina, específico
à semente, modificado para conter um local de
ligação para a Escherichia coli TET repressor (R). A
expressão dessa linhagem permite uma planta normal e o
desenvolvimento de sementes, mas inibe a germinação das
sementes. As plantas contendo a linhagem SL foram cruzadas com
plantas contendo o gene tet R para derivar plantas onde a
expressão da linhagem SL fosse reprimida. Plantas que
continham as duas linhagens mostraram formação e
germinação normais de sementes, enquanto que as
sementes onde a linhagem SL foi separada do gene R através da
segregação, não germinaram. As exigências
desse método para controlar de modo eficaz o fluxo de
traços novos entre plantas sexualmente compatíveis
é discutido.
Uma
das maiores preocupações quanto ao uso indiscriminado
de plantações geneticamente modificadas, é que
elas podem transmitir traços novos para plantas nativas, ou
que os traços novos possam contaminar outras espécies
relacionadas de plantas. Isto é mais preocupante em
plantações onde a semente é guardada, pois a
semente formada pela polinização cruzada de variedades
portando genes modificados, pode levar a populações
onde o gene transformado torna-se estabelecido. Assim, um mecanismo
para reduzir a incidência de transferência de
traços modificados para a semente de plantas nativas ou
parentes pode limitar os traços modificados à variedade
específica sendo cultivada. Exemplos de técnicas atuais
de contenção incluem herança materna,
esterilidade do macho, esterilidade da semente, hermafroditismo,
apomixia, genomas incompatíveis e mitigação
transgênica através do controle temporal ou de tecido
específico de genes suicidas (revisto na ref. 1). Neste
artigo, descrevemos uma abordagem da contenção de
genes, que se fia à manutenção de um gene letal
à semente (SL) (que pode ser ligado a um traço
modificado) e um elemento repressor (R) adicionado pelo cruzamento. O
objetivo do método é atingir a repressão da
letalidade da semente, combinando a linhagem SL com a linhagem R.
A
combinação dos dois elementos leva à
repressão do gene SL, permitindo assim a auto
propagação de sementes da própria planta. Mas a
mediação do pólen no cruzamento pode resultar na
separação dos dois elementos, em cujo caso a linhagem
SL é ativada no embrião da semente, causando a
interrupção da germinação para sementes
contendo a linhagem SL e o traço modificado ligado. (Fig 1) Em
condições ótimas, (sítios únicos
SL e R no mesmo local dos dois cromossomas pais) o método
seria simples e eficiente, e não exigiria nenhuma
intervenção sob condições controladas. No
exemplo apresentado, a letalidade da semente é atingida pela
super produção específica a embriões de
auxina mediada pelos produtos da Agrobacterium tumefaciens gene 1,
tryptophan 2-monooxigenase (iaaM) e gene 2, indole-3-acetamide
hidrolase (iaaH). As duas enzimas se combinam de forma rara,
não conhecida em outras plantas, para produzir o ácido
indole-3-acético, enquanto que o iaaM é a enzima
limitante (2 - 4). A expressão específica à
semente é mediada pelo promotor da phaseolina específica
a embriões do feijão, Phaseolus vulgaris (5). A
repressão da linhagem SL é oferecida pelo elemento R
tetR que age no local de ligação, tetO, que foi
introduzido na região central do promotor de phaseolina. (Fig
2). Os dois elementos tetR e tetO são derivados da Escherichia
coli onde fazem parte de um "operon" que regula a
resistência à tetraciclina. (Fig 6). A funcionalidade do
sistema tetR and tetO como um sistema de controle genético em
plantas já foi demonstrada várias vezes (7 - 9). Neste
estudo, usamos tabaco transgênico para testar se era
possível a) atingir a letalidade específica à
semente; b) reprimir o gene SL e c) manter plantas auto-polinizadas
contendo os elementos SL e R durante várias gerações.
Protocolo
Experimental
Vetores
e Linhagens
Para
facilitar a subclonação, o plasmídeo pGEM7Zf(_)
(Promega) foi modificado através da inserção de
sítios de restrição para NcoI, BglII, PstI, e
EcoRV entre os sítios ClaI e BamHI.
O
promotor de phaseolina para o promotor de phaseolina-SL, linhagem
(P-SL) foi amplificado por PCR de pAGM219 (obtido de Mycogen, ...) e
corresponde aos nucelotídeos 128-933 da seqüência
GenBank J01263 (10). Sítios de restrição para
XhoI e HindIII foram adicionados aos primers. O promotor da
phaseolina para a linhagem do promotor da phaseolin com
seqüências tet-SL (P-TOP-SL) também foi amplificado
por PCR de pAGM219. Isso corresponde aos nucleotídeos 128-833
de J01263. Sítios de restrição para XhoI e
Csp45I foram adicionados aos primers. As duas fitas da
seqüência tripla foram sintetizadas quimicamente, e os
sítios Csp45I e ClaI foram adicionados. A seqüência
da fita (_) é 5_-CGAAGACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTGATAGAGTGAACTCTATCAGTGATACAGTAT-
3_. O terminador de phaseolina foi extirpado como um fragmento PstI
do pAGM219. A região de codificação do gene 1
foi isolada por PCR do plasmídeo p202 (obtido do Mycogen) e
subclonada como um fragmento ClaI. A seqüência corresponde
aos nucleotídeos 5755-8056 do pTi 15955 (11). O gene 2, que
inclui suas próprias regiões de promotor e terminador,
foi isolado por PCR do p101 (obtido do Mycogen) e subclonado como um
fragmento SphI. A seqüência corresponde aos nucleotideos
5785-3237 do pTi 15955 (11). Para a transformação das
plantas, as linhagens foram clonadas no vetor binário Bin 19
(12) para dar os plasmídeos P-TOP-SL e P-SL, respectivamente
(Fig. 1).
Transformação
das Plantas. O Tobacco cv Wisconsin 38 (W38) foi
transformado usando-se o método do disco de folha (13) e a
cepa Agrobacterium EHA 105. 53 linhas transgênicas contendo as
linhagens PTOP-SL e nove linhas com a linhagem P-SL foram mantidas
para análise posterior. O tabaco W38 transgênico
já transformado com pTet1 (linhas R) foi obtido de C. Gatz.
... Todas as plantas transgênicas foram cultivadas em estufas
com um ciclo de luz 16:8h.
Análise
da Germinação. Sementes estéreis de
cada linha (88 por planta) foram colocadas em placas de Petri de 9 cm
em meio Murashige e Skoog (MS) com ou sem kanamicina. As mudas foram
analisadas após 4 semanas de germinação. As
linhas T0 SL que apresentaram fenótipos foram mantidas para
cruzamento com linhas R.
Análise
PCR de Plantas Transgênicas. O DNA foi preparado a
partir de mudas e plantas maduras de acordo com o método de
Edwards et al. (14), porém com uma modificação:
foi realizada uma extração adicional de
clorofórmio antes da fase de precipitação do
DNA. O PCR foi realizado em 96 placas, usando-se o par primer
gctcacccatctcaacccacac e tctaagaaggcatcggaaacc para detectar a
presença do gene 1, e do par primer attgagatgttagataggcac e
ccactttcacatttaagttg para detectar a presença do gene tetR.
Condições de ciclo incluíram um passo inicial a
94°C durante 3 min seguido de 30 ciclos de 45 s a 94°C, 1
min a 56°C, 1 min a 72°C, e um passo final a 72°C
durante 5 min.
Resultados
Transformação
de Plantas de Tabaco. Duas linhagens, P-SL e PTOP-SL foram
preparadas para avaliar o efeito do gene 1 e gene 2 no
desenvolvimento da semente de tabaco e a habilidade de reprimir
P-TOP-SL com o tet R (Fig. 2). 53 plantas transformadas com a
linhagem P-TOP-SL e 10 plantas transformadas com a linhagem P-SL
(linhagens SL contendo genes SL) foram selecionadas para
análise com base na presença de linhagem SL, como
determinado pelo "Southern blots" (dados não
informados). Todas as plantas transformadas mostraram um
desenvolvimento vegetativo e produção de sementes
normais. Uma média de quatro flores por linhagem SL foram
auto-polinizadas ou sofreram polinização cruzada, com
tabaco não transformado (retrocruzadas) ou com plantas
portando o gene tetR (linhagens R, contendo o gene R). As sementes
resultantes foram germinadas em meio de cultura, com e sem kanamicina
(n _ 88 por cruzamento). O número de sítios SL ativos
foi determinado através da contagem do número de
fenótipos SL e de mudas resistentes e sensíveis à
kanamicina, obtidos de plantas auto polinizadas e retrocruzadas.
(Tabela 1). A herança do genótipo SL e/ou R foi
determinada por um PCR duplex, usando-se pares de primers de genes
específicos para o gene 1 e tetR.
Especificidade
da Semente das Linhagens SL. As plantas P-TOP-SL e P-SL
apresentaram a mesma taxa de inibição de
germinação de sementes no meio sólido MS. As
sementes de uma única linhagem transformada apresentaram uma
das combinações de 4 fenótipos determinados de
modo arbitrário (Fig. 3). Dos transformantes primários,
41 plantas contendo a linhagem P-TOP-SL e nove plantas contendo a
linhagem P-SL que segregaram os fenótipos SL foram
recuperadas. Com base nos resultados das análises de
germinação, o número de sítios SL foi de
1 a 4 (Tabela 1). Quando sementes da linhagem SL foram colocadas no
solo, e não no meio de cultura, para refletir as
condições naturais, a diferença entre a
germinação normal e a letalidade das sementes ficou
muito óbvia. Somente sementes de plantas que perderam o
genótipo SL através da segregação
germinaram, e não foram observados fenótipos
intermediários. Em condições típicas de
germinação no solo, a linhagem SL ofereceu uma completa
inibição da germinação (dados não
informados). Algo também crucial para nossa abordagem foi a
demonstração de que a introdução da
seqüência de ligação tetO no âmago do
promotor de phaseolina não afetou a especificidade, e que as
duas linhagens SL não mostraram nenhum efeito na viabilidade
do pólen, e portanto foi observada a fertilidade normal do
macho.
Repressão
do Fenótipo SL através do TETR. As linhas SL
contendo a linhagem P-SL ou P-TOP-SL foram cruzadas com uma linha R
estabelecida (obtida de C.Gatz), que havia sido transformada com
pTet1 (8). Uma linha R mostrando a mais alta expressão tetR,
como determinado pelo "Northern blots" (resultados
não informados), foi usada na polinização
cruzada. As sementes resultantes destes cruzamentos foram germinadas
em meio MS contendo kanamicina (n _ 88 por planta). A
freqüência de fenótipos resistentes à
kanamicina e SL foi marcada após 4 semanas de
germinação.
Se
o TETR reprime a expressão da linhagem SL, plantas de
desenvolvimento normal contendo os genes SL e R podem ser esperadas.
[referidas como N_(SL;R) para plantas de fenótipo normal e
(genótipos SL e R)]. Mudas normais resistentes à
kanamicina foram testadas por PCR duplex para averiguar a
presença dos genes SL e R. Uma média de duas plantas
N_(SL;R) por cruzamento foram mantidas e cultivadas para cruzamento
posterior. Com base na relação entre plantas
resistentes e plantas sensíveis à kanamicina, a
linhagem R usada para os cruzamentos possuía mais de quatro
sítios tetR. Das 37 diferentes plantas com transformante
primário P-TOP-SL que foram cruzadas com a linha R, 21
produziram plantas N_(SL;R), indicando repressão do
fenótipo SL no F1. Mas a porcentagem de repressão
variou entre cruzamentos individuais, e mudas com o fenótipo
SL apareceram em todos os cruzamentos.
As
16 plantas F1 restantes não produziram plantas N_ (SL,R),
indicando que nenhuma repressão ocorreu nestas linhagens. As
mudas destas plantas que se desenvolveram normalmente eram apenas do
genótipo N_(R;R) (Tabela 1). A análise PCR da
geração F1 revelou que 40% das mudas que se
desenvolveram normalmente da linhagem (SL_R) tinham o genótipo
N_(SL;R), enquanto que 60% eram N_(R;R). Nenhum genótipo
N_(SL;SL) foi detectado (Tabela 2). Como um gene 1 silencioso ou
não funcional pode também explicar o desenvolvimento
normal de uma planta com um genótipo (SL;R), as linhas
N_(SL;R) foram propagadas após a segregação do
fenótipo SL.(Tabela 1). As 21 linhas F1 que produziram a
progenia N_(SL;R) foram propagadas através da auto
polinização e do retrocruzamento com tabaco W38
não transformado.
Todas
as linhas F2, auto polinizadas e retrocruzadas, produziram mudas com
fenótipos SL observáveis como resultado da
segregação da linhagem SL do gene R (Tabela 1). Esta
descoberta é uma indicação de que a
repressão do gene 1, e não o silenciamento da linhagem
SL, gerou as plantas N_(SL;R) da geração anterior.
Mudas com desenvolvimento normal foram mais uma vez analisadas por
PCR duplex. Para todas as linhas F2, o genótipo N_(SL;R)
estava presente em 29% das amostras, e 71% eram de N_(R;R). Nesta
geração, uma linha auto polinizada produziu
também plantas N_(SL;SL), que totalizaram cerca de 0,4% das
amostras totais. (Tabela 2). Os resultados na Tabela 2 mostram que os
retrocruzamentos, como era de se esperar, resultaram em um
número bem menor de plantas com o genótipo N_(SL;R), se
comparado à geração F1 auto polinizada, devido
à segregação da linhagem SL da R. No total, 18
das 21 linhas produziram plantas N_(SL;R) na geração
F2, indicando que uma repressão mais consistente do
fenótipo SL pode ser alcançada em linhas SL
transgênicas estáveis.
O
Genótipo N_(SL;SL) Não Está Presente nas
Plantas F1. A repressão-depressão da linhagem
SL é confirmada também pela análise da
segregação do genótipo SL. A
freqüência de mudas N_(SL;SL) de desenvolvimento normal
é um indicador da funcionalidade da linhagem SL, já que
as plantas N_(SL;SL) indicariam perda da função SL. Das
39 plantas SL que foram inicialmente cruzadas com linhas R, nenhuma
produziu mudas com apenas o genótipo (SL;SL) em F1 (Tabela 2).
Em mudas desta linha com desenvolvimento normal, a linhagem SL
pôde, sem exceção, ser detectada apenas em
combinação com o gene tetR. Mas em F2, uma linha
produziu plantas do genótipo N_(SL;SL), embora provavelmente
isso tenha sido causado por um sítio SL segregado e inativo,
pois a mesma linha também apresentou sítio SL
funcional. De qualquer maneira, nenhuma linha apresentou uma perda
completa da função SL.
A
Linhagem P-SL Não Intervém na Repressão. Os
cruzamentos de controle realizados com plantas P-SL que contêm
o promotor de phaseolina sem o elemento de ligação tetO
ofereceu evidências adicionais de que o TETR é
responsável pela perda do fenótipo SL. Das nove linhas
P-SL que foram cruzadas com linhas R, todas produziram os mesmos
fenótipos SL que a linhagem P-TOP-SL. Em linhas onde mudas
normais apareceram, elas eram do genótipo N_(R;R), com uma
exceção. (Tabela 2). A única linha que produziu
plantas N_(SL;R) continha vários sítios SL e mostrou um
grande número de fenótipos SL menos severos na progenia
da geração T0 auto polinizada. É possível
que a segregação destes sítios fracos de SL na
geração F1 tenha causado o aparecimento do
fenótipo normal observado.
Discussão
O
número maior de lavouras com características
modificadas eventualmente vai exigir sistemas que assegurem que as
combinações genéticas nestas plantas sejam
mantidas, e não facilmente transferidas para outras
espécies ou para plantas nativas relacionadas. Portanto,
não causa surpresa o fato de existir um esforço
considerável para o desenvolvimento de métodos para a
contenção de transgenes ou para a
restrição do fluxo de genes em geral. Estas tecnologias
podem ser divididas em tecnologias de restrição do uso
de genética condicional, onde a contenção
geralmente é obtida através da aplicação
de um indutor químico (15-20) ou de métodos não
condicionais que não exigem intervenção, como a
restrição do transgene para a herança materna
através do uso da transformação do cloroplasto. (21)
O
sistema de repressão-depressão que descrevemos aqui
é simples e pode oferecer um mecanismo para controlar a
disseminação e o estabelecimento indesejável de
traços modificados entre espécies de plantas
sexualmente compatíveis, sem a necessidade de
intervenção. O método tira vantagem do fato de
que a maioria das plantações representa
combinações específicas de genes, mantidas
durante o cultivo. Combinando genes potencialmente conflitantes, como
os transgenes, numa mesma combinação genética
que seja nociva na ausência de um R, a combinação
de transgenes será rapidamente eliminada de uma
população nativa ou não cuidada, sem um
sítio R administrado. O uso deste sistema em
condições agrícolas típicas, onde a
semente é colhida, novas variedades são semeadas e as
plantações são alternadas, pode impedir o
estabelecimento de traços modificados em
populações involuntárias.
O
sistema SL reprimível avaliado aqui é eficiente sob
condições experimentais. No entanto, é
óbvio que para uma aplicação bem sucedida no
campo, o sistema deva ser otimizado. Durante a avaliação
do sistema, não foi realizada nenhuma
pré-seleção dos transformantes primários
com relação a parâmetros como fenótipo,
número de inserções ou número de
sítios SL ou R. Isto, de certa forma, complicou a
análise genética, mas por outro lado, ofereceu uma
visão melhor das exigências mínimas
necessárias para se alcançar a letalidade da semente e
sua completa repressão após uma sucessão de
cruzamentos. A análise dos dados apresentados aqui leva a
várias conclusões sobre como o sistema pode ser
otimizado. O parâmetro mais crítico é assegurar
uma repressão severa. Num sistema ideal, apenas um sítio
R e um sítio SL deveriam estar presentes, e portanto a
eficácia do R e a atividade do promotor específico
à semente devem ser otimizados, para que, quando combinados,
funcionem de modo confiável. Isto pode ser obtido tornando os
locais de ligação tetO e/ou o TETR mais eficazes. Por
exemplo, a seqüência TOP usada neste estudo, mostrou em
outros estudos, um nível basal de atividade baixo (22), e uma
repressão mais severa foi obtida com graus mais altos de
oligomerização dos locais de ligação R
(23). Como o gene 1 é o componente chave para a letalidade,
enfatizamos que deve ser usado um promotor específico à
semente mais fraco e mais fácil de reprimir para a
expressão do gene 1, já que o efeito SL foi tão
claramente evidente com o promotor de phaseolina, principalmente em
condições de solo.
Finalmente,
para uma verdadeira contenção de todos os transgenes,
a própria linhagem R, embora não deva oferecer nenhuma
vantagem ou desvantagem genética, deve ser controlada
também. Isto pode ser obtido usando-se um sistema de
repressão dupla e associando-se um componente letal adicional
à linhagem R (24). Em tal sistema de repressão dupla,
é necessária a inserção específica
das linhagens SL e R complementares nos mesmos cromossomas, para
evitar a co-segregação do R e para se obter a
segregação completa dos componentes SL e R durante os
cruzamentos.
Em
resumo, mostramos que o gene 1 e o gene 2 da Agrobacterium em
combinação com os componentes tetO_tetR, regulando o
promotor de phaseolina, podem ser usados para promover e reprimir a
letalidade das sementes. Embora o sistema repressor bacteriano Tet
tenha funcionado em plantas (7-9), nosso exemplo mostra um sistema
repressor específico a tecidos com base no tet R. Será
interessante observar se esta abordagem pode ser aplicada a outros
promotores de plantas específicos a tecido ou
induzíveis. O sistema apresentado aqui pode ser usado como
modelo na questão do gerenciamento de transgenes e
preservação de combinações
genéticas específicas no geral.
Agradecemos
ao Dr. C. Gatz por oferecer as linhagens e sementes de tabaco
transformadas. As importantes contribuições dos Drs. G.
Cardineau e M. Murray são também reconhecidas.
Agradecemos também aos Drs. L. Foster e J. Singh pela leitura
crítica deste manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pela
Dow Agrosciences Canadá e Agriculture and Agri-Food
Canadá como parceiros do projeto MII.
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