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 O
Bacharelado de Genética do Curso de Ciências
Biológicas da UFMG é um dos melhores do Brasil. É
um celeiro de revelação de novos pesquisadores. Quando
estes jovens ingressam no nosso mestrado estão com farto
material para ser utilizado nas suas dissertações.
Na
minha coluna desta edição do jornal da ANBio, convidei
dois destes cérebros para apresentarem os seus trabalhos com
vacinas usando Salmonella como vetor. Observando os últimos
artigos da minha coluna, tenho notado que a revelação
de novos talentos está sendo a sua maior missão.
Prof.
Vasco Azevedo, Chefe do
Laboratório de Genética Celular e Molecular (LGCM),
ICB, UFMG.
Tel/Fax:
(31) 34992610 o E-mail: vasco@mono.icb.ufmg.br. |
A
produção de vacinas utilizando linhagens bacterianas
apresenta muitas vantagens como: baixo custo de
preparação, fácil transferência de
tecnologia, alta meia-vida, estabilidade e fácil
administração. Além dessas vantagens, existe a
possibilidade, extraordinária de induzir resposta imune em
sítios específicos. Várias linhagens de
bactérias vivas - comensais ou patogênicas atenuadas -
têm sido utilizadas com sucesso. Dentre as comensais,
destacam-se: Streptococcus gordoni, Lactobacillus spp. e
Staphylococcus spp.; e dentre as atenuadas, as mais empregadas
são: Mycobacterium bovis BCG, Listeria monocytogenes, Yersinia
enterocolitica e Salmonella spp. Essa última tem sido uma das
mais bem caracterizadas para o uso em vacinas que utilizam as mucosas
para induzirem imunidade protetora.
Muitos
agentes infecciosos têm como principal meio de acesso ao
hospedeiro as membranas de mucosa, ou sua passagem por esta via
constitui um passo crítico para seu processo de
infecção. Portanto, a estimulação de uma
resposta imune eficaz, não só a nível
sistêmico como também de mucosa após a
vacinação, é altamente desejável,
representando uma vantagem significativa na prevenção
da infecção. Essa meta só pode ser
alcançada quando a vacina é administrada por esta via.
Dentre as técnicas disponíveis para estimular respostas
imunes eficientes, o uso de bactérias como carreadoras de
antígenos vacinais provavelmente constitui uma das
estratégias de maior sucesso e algumas linhagens do
gênero Salmonella têm sido utilizadas para esta finalidade.
As
salmonelas são bactérias Gram-negativas e o seu
gênero compreende duas espécies: Salmonella bongori e
Salmonella enterica. Essa última espécie é
extremamente heterogênea, possuindo aproximadamente 2000
sorotipos, isto é, grupo de linhagens que compartilham
antígenos de superfície reconhecidos por anticorpos
específicos. Historicamente, estes sorotipos eram considerados
diferentes espécies, o que foi mais tarde contestado e levado
à designação de uma única espécie,
S. enterica, a qual engloba todas as variantes.
 Dentre
os sorotipos isolados de importância para o homem, destacam-se
a S. enterica sorotipo Typhi (S.Typhi) e a S. enterica sorotipo
Typhimurium (S.Typhimurium). S.Typhi é o agente
etiológico da febre tifóide, uma doença que
afeta 33 milhões de pessoas anualmente, levando a 500 mil
mortes no mundo. Já S.Typhimurium é um dos agentes
causadores das gastroenterites humanas cuja incidência tem
aumentado de maneira significante em todo o mundo nos últimos
anos. A pesquisa de vacinas envolvendo bactérias do
gênero Salmonella iniciou-se com a busca por medidas
profiláticas eficientes contra estas salmoneloses e mais tarde
estendeu-se para diversas outras doenças.
A
primeira vacina utilizando Salmonella foi desenvolvida no final do
século XIX, com o objetivo de combater a febre tifóide.
Esta vacina consistia em bactérias mortas pelo calor,
preservadas em fenol e administradas por via parenteral. Devido a sua
razoável eficácia e às fortes
reações adversas, como febre e convulsão, esta
vacina foi considerada inviável para o uso em programas de
saúde pública. A partir da década de 70, duas
vacinas foram desenvolvidas e estão licenciadas para o uso
contra a febre tifóide: uma vacina baseada no antígeno
Vi de S.Typhi e uma vacina viva oral atenuada utilizando S. Typhi
linhagem Ty21a. Essa última mostrou-se muito segura e bem
tolerada. Posteriormente, linhagens atenuadas de Salmonella
carreadoras de antígenos de outros patógenos foram
usadas no desenvolvimento de vacinas vivas orais contra muitas outras
doenças, como mostrado na Tabela 1.
 Linhagens
atenuadas de Salmonella apresentam peculiaridades interessantes para
a produção de vacinas, como a possibilidade de
utilização de técnicas de
manipulação genética desenvolvidas para E.coli
K12, além da administração por via oral e o
tropismo pela mucosa intestinal. No intestino, o GALT (tecido
linfóide associado ao trato gastrointestinal) protege o nosso
organismo de agressão exógena, discriminando entre
alimentos essenciais e partículas danosas, microrganimos
comensais e patógenos perigosos. Uma importante
característica do processo infeccioso das salmonelas consiste
na exploração das células do GALT, o que leva a
uma resposta imune humoral (mediada por anticorpos) e/ou resposta
imune celular, levando à imunidade de mucosa e sistêmica.
A
construção de linhagens atenuadas de Salmonella
é feita através de mutações em genes
importantes para esta bactéria. Os principiais genes alvo
destas mutações podem ser divididos em três
categorias: os que participam do processo de regulação
gênica, os relacionados com a síntese de fatores de
virulência e os envolvidos com o metabolismo
biossintético. Dentro desse último grupo, as linhagens
vacinais mais utilizadas possuem deficiência na
biossíntese de compostos aromáticos (tirosina,
fenilalanina, triptofano, vitamina K). Após serem ingeridas,
linhagens de Salmonella deficientes em genes aro (aromáticos)
permanecem nos tecidos do hospedeiro por alguns dias, mas são
incapazes de manter uma infecção por serem deficientes
na produção de compostos essenciais, o que é uma
medida de biossegurança, pois diminui a possibilidade de
ocorrer reversões destes mutantes para sua forma selvagem.
Além disso, em geral são produzidas linhagens vacinais
que possuem duas ou três mutações adicionais.
Dentre as Salmonella vacinais aro com estas mutações,
destacam-se as linhagens SL3261 de S. Typhimurium e CVD908 de S.
Typhi.
A
utilização de bactérias carreadoras de
antígenos vacinais exige cuidados devido ao fato de estas
serem organismos geneticamente modificados (OGMs). Os possíveis
problemas que estes organismos podem apresentar incluem a
reversão à forma selvagem, a reatogenicidade, a
transferência gênica horizontal e a possibilidade de os
antígenos recombinantes desencadearem uma resposta imune
exacerbada no hospedeiro. De acordo com a literatura, não
houve nenhum caso de reversão à virulência quando
utilizada a linhagem vacinal S.Typhi Ty21a em testes clínicos.
Apesar disso, todos estes fatores devem ser levados em conta ao se
desenvolver uma vacina viva para uso humano.
O
Laboratório de Genética Celular e Molecular (LGCM) do
Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG), coordenado pelo professor Vasco
Azevedo, possui uma linha de pesquisa que utiliza Salmonella
Typhimurium SL3261 no desenvolvimento de vacinas vivas. O nosso
trabalho de bacharelado em genética baseia-se em utilizar
Salmonella recombinante carreadora do gene Sm14, um antígeno
de superfície do Schistosoma mansoni, para a
produção de vacinas contra a esquistossomose. Este
projeto possui colaboração com os professores Alan Lane
de Melo, do Laboratório de Taxonomia e Biologia de
Invertebrados, e Sérgio Costa Oliveira, do Laboratório
de Imunologia das Doenças Infecciosas, localizados na mesma Universidade.
A
esquistossomose é uma doença endêmica que afeta
200 milhões de pessoas em mais de 70 países. No Brasil
são estimadas 8 milhões de pessoas infectadas, com
grande foco na região NE. Apesar da existência de
diferentes estratégias de controle, a esquistossomose é
uma doença que continua em expansão. Este fator, somado
à magnitude da endemia, justifica o interesse em se
desenvolver um método eficiente no combate a esta parasitose.
Atualmente a quimioterapia vem sendo utilizada como principal medida
profilática, porém sua ação se limita a
curto prazo, uma vez que podem ocorrer reinfecção e
resistência à droga utilizada. Dentro deste contexto,
uma das estratégias determinadas pela Organização
Mundial de Saúde (OMS) é o desenvolvimento de uma
vacina efetiva e segura. A OMS selecionou seis moléculas
candidatas para serem testadas no desenvolvimento de vacinas contra a
esquistossomose (Sm23, Sm28-GST, Sm97, TPI, cercária irradiada
e Sm14).
Para
desenvolvermos o nosso projeto escolhemos o antígeno Sm14, em
razão de já existirem trabalhos do nosso grupo com ele
e por já ter sido demonstrado que ele induz
proteção parcial em camundongos após
vacinação e desafio com cercárias.
No
nosso trabalho utilizamos um vetor eucarioto e um vetor procarioto
contendo o gene Sm14 para o desenvolvimento de vacinas de DNA e
proteína, respectivamente. Estes vetores foram transformados
separadamente na linhagem aroA SL3261 de Salmonella Typhimurium e as
bactérias recombinantes foram utilizadas em ensaios de
imunização oral de camundongos SWISS. O período
de imunização consistiu de 7 doses da vacina no
intervalo de 30 dias. Quinze dias após a última
imunização, os camundongos foram desafiados com cerca
de 50 cercárias da cepa LE de S. mansoni e quarenta e cinco
dias depois os parasitas foram recuperados para a
avaliação de proteção. A
estimulação da resposta imune foi avaliada
através de ensaios de ELISA de amostras de sangue e fezes dos
camundongos, nos quais foram pesquisadas as presenças dos
anticorpos IgG e IgA, respectivamente, em diferentes intervalos
durante o experimento. Por último, avaliamos a postura de ovos
dos parasitas através da análise histológica dos
fígados dos animais usados nos experimentos. Os resultados
obtidos até agora mostraram 45,3% de redução da
carga parasitária dos camundongos que foram vacinados com
Salmonella expressando o antígeno Sm14. Também para
este grupo foi observada uma redução do número
de parasitas fêmeas. Isso é importante, pois implica na
diminuição do número de ovos nos fígados
dos animais, e portanto, há uma atenuação do
processo inflamatório neste órgão. Um outro
resultado relevante foi a constatação da
indução de resposta imune sistêmica pela
detecção de anticorpos específicos no sangue dos
animais vacinados. Estamos atualmente repetindo estes experimentos e
vários testes estão em andamento no LGCM, para
confirmarmos se a proteção que obtivemos é
significativa e, com isso, provarmos que podemos utilizar as nossas
linhagens recombinantes de Salmonella como vacinas vivas. |
